Producción y purificación de la LAPyspII recombinante producida en la levadura Pichia pastoris, estudio cinético y determinación de metales
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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
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"Las LAPs pertenecen a las familias M1 y M17 constituyen un grupo de metalopeptidas dependientes del ión zinc y/o manganeso. Poseen funciones diversas como la inactivación de polipeptidasas, regulación de la meiosis así como en parásitos se propone como blanco terapéutico para una posible vacuna. En nuestro laboratorio en 2007 se puso en evidencia una nueva exopeptidasa citosólica en la levadura Schizosaccharomyces pombe, denominada Leucín-aminopeptidasa yspII (LAPyspII), es dependiente de Mn2+, pertenece a la familia M17, es una proteína hexamérica de 320 KDa, con monómeros de 54 KDa. Aún no se conoce si tiene Zn2+ y/o Mn2+ en su sitio activo. Para avanzar en la caracterización molecular, se obtuvo una cepa productora de la LAPyspII en la levadura Pichia pastoris (PpX33-LAPII) donde al gen de la alcohol oxidasa (AOX1) del cromosoma de la cepa X33, se le insertó el ORF del gen ape2, el ORF cuenta con un factor ?, que codifica para una secuencia señal que le permita a la proteína ser expulsada al medio extra celular, también cuenta con un motivo de 6 histidinas (his-6x) lo que facilita su purificación e identificación por western-blot. El gen ape2 se insertó por desplazamiento del gen AOX1, teniendo así un fenotipo Mut+, esto quiere decir que cuando se pone la cepa en presencia de metanol como fuente de carbono, se enciende el gen AOX1 para su crecimiento y sobreexpresión de la LAPyspII. El objetivo del presente trabajo de tesis es producir la LAPyspII recombinante en Pichia pastoris purificarla por cromatografía de afinidad por inmovilización de metales (IMAC), determinar los parámetros cinéticos, así como también la determinación de metales en su estructura por el método de PIXE."
Keywords
Biología y Química, Metaloproteinasas, Metaloenzimas, Saccharomycetaceae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris
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