Browsing by Author "Lara Ochoa, Cristina"

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  • Tesis de maestría
    Mutantes del activador transcripcional PerA que alteran la expresión de los genes bfp en Escherichia coli enteropatógena
    (Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Lara Ochoa, Cristina; Puente García, Jose Luis; Martínez Laguna, Ygnacio
    Los factores de virulencia de EPEC están bajo el control de diversos reguladores, uno de ellos es la proteína PerA, que tiene un papel central en la regulación de la expresión del pilus BFP ("Bundle-forming pilus") y del operón perABC. PerA pertenece a la familia de activadores transcripcionales AraC/XyIS. En general, las proteínas de esta familia están formadas de 2 dominios: uno altamente conservado ubicado en el extremo carboxilo, donde se encuentran dos motivos de unión a DNA tipo HTH y un posible sitio de unión a la RNAP; y un dominio menos conservado ubicado en el extremo amino, relacionado con la unión a efectores y con procesos de dimerización. El objetivo de este trabajo fue caracterizar distintas mutantes en PerA con la finalidad de establecer la importancia funcional de los dominios amino y carboxilo. Mutantes en el extremo amino. Se analizaron dos mutantes en el extremo amino: la proteína PerA-130-49 (B2), generada por PCR inverso y que carece de 20 aminoácidos de la posición 30 a 49 de PerA, perdió la capacidad de activar la fusión bfpA-cat y de unirse a la secuencia reguladora de bfpA, incluso al adicionar un exceso de 20 veces con respecto al control. La mutante PerA-Q40R-F411, generada por PCR mutagénico y que tiene una doble mutación en el extremo amino en la posición 40 de una Q por R y 41 de una F por I, presentó una disminución del 80% en la capacidad de activación de la fusión bfpA-cat en comparación con la silvestre. Al analizar la interacción con el DNA, se observó un retardo, pero sólo cuando se usó un exceso de 17 veces de proteína. Tales resultados señalan la importancia del dominio amino de PerA en el reconocimiento del promotor y en la activación transcripcional de bfpA. Mutantes en el extremo carboxilo. Para analizar la importancia del dominio carboxilo se evaluaron las siguientes proteínas: PerA-Y255A y PerA-K249M-Y255A, las cuales fueron generadas por OE-PCR y que portan mutaciones en el HTH2, resaltaron la importancia de este dominio en la funcionalidad de PerA, debido a que su capacidad para activar la transcripción de la fusión fue reducida drásticamente. Además, estas mutantes perdieron su capacidad de unión al DNA, a pesar de adicionar un exceso de proteína. En la mutante PerA-P259A (generada por OE-PCR) que tiene un cambio de una prolina posterior al HTH2, la cual está altamente conservada dentro de la familia AraC/XyIS, se observó la pérdida de la función de PerA, lo que indicó que este aminoácido es esencial en mantener una correcta estructura del HTH2. Por último, la mutante PerA-S162R (construida por mutagénesis sitio dirigida) que posee un cambio de una S por R en la posición 162, favoreció una mayor actividad de la fusión bfpA-cat con respecto a la silvestre y, de manera interesante, no fue regulada completamente en presencia de amonio. En el EMSA, esta mutante retardó el DNA con la misma afinidad aparente que la proteína silvestre. Es posible que el residuo de serina 162 en PerA forme parte del sitio de interacción con un posible regulador aún desconocido que responde al amonio, o bien, que el cambio por arginina permitió una mayor afinidad por la RNAP. En conjunto, estos resultados indican que ambos dominios en PerA favorecen la conformación que le permite a PerA interaccionar con el DNA y activar la transcripción del gen bfpA.