Browsing by Author "Rubio Nava, Karla Maria"

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  • Tesis de maestría
    Caracterizacion de las isoformas de la enzima convertasa de pro-proteinas PC1 en cerebro de raton; su distribucion subcelular en la via secretora y su liberacion de la fraccion sinaptosomal
    (Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2011) Rubio Nava, Karla Maria; Padros Semorile, Maria Rosa; Vindrola Asti, Osvaldo
    Desde el descubrimiento de la biosintesis de la enzima PC1 en las células de corticotrofos de ratón AtT-20 en 1992, y del esclarecimiento de la isoforma que presenta la actividad biológica, el patrón de procesamiento de la pro-PC1 descrito por estos autores no ha sido refutado hasta la fecha. Sin embargo, usando otros modelos experimentales se han agregado algunas isoformas de la enzima, las cuales son dependientes del tejido en estudio. En el presente trabajo de Tesis se demostró que todas las isoformas encontradas en los diversos tejidos y lineas celulares (controles y transfectadas) se encuentran en las fracciones subcelulares del cerebro de ratón. Trabajando con fracciones microsomales, sinaptosomales crudas y sinaptosomales enriquecidas encontramos moléculas de 52, 66, 70, 76, 87, 92 y 94 kDa, las cuales presentan concentraciones diferenciales en cada fracción subcelular y distinta topologia en cada una de ellas. Además de esclarecer que se encuentran como monómeros. La única de estas moléculas que se encuentra en forma soluble y parcialmente asociada a la membrana en estos organelos es la molécula de 66 kDa, la cual fue definida originalmente como la única enzima biológicamente activa y que no contiene la región carboxilo terminal. Todas las otras isoformas, contienen el carboxilo terminal, se encuentran asociadas a membrana y, según experimentos bioquímicos clásicos que realizamos, presentaron el comportamiento de proteinas transmembranales. De las isoformas encontradas, las de 66, 87 y 94 kDa se encuentran mayoritariamente concentradas en los microsomas; mientras que las de 70, 76 у 92 kDa alcanzan los mayores niveles en la fracción sinaptosomal, la cual contiene los gránulos secretorios electrodensos. Hasta ahora se pensaba que la molécula de 66 kDa debería encontrarse mayoritariamente en los granulos secretorios, sin embargo, hasta la fecha no se habia realizado un estudio de fraccionamiento subcelular para corroborarlo. Varios trabajos sostienen que la región carboxilo terminal es necesaria para que la PC1 reconozca microdominios del TGN que le van a permitir introducirse en los gránulos secretorios sintetizados a partir de esta estructura. Esto nos sugiere que la molécula de 66 kDa seguiría un mecanismo alternativo al de las moléculas que contienen esta región. Los estímulos específicos para inducir la liberación de los productos almacenados en gránulos secretorios (activación de PKA y PKC) incrementaron notablemente la secreción de las isoformas de 66, 70, 76 y 87 kDa. Las únicas dos moléculas que no fueron detectadas en el medio de cultivo son la de 92 y 94 kDa. Por otro lado, en este trabajo de Tesis demostramos que la enzima PC1 transmembranal no solamente sigue la vía clásica regulada, que es la única reportada hasta ahora, sino que también ingresa a la vía constitutiva y es transportada a la membrana plasmática de sinaptosomas y de clones (PC1 +) de una línea celular neuronal diferenciada. De acuerdo a los experimentos de distribución subcelular, método de deslipidización de membranas, inmunopurificación, liberación de sinaptosomas por estímulos específicos e inmunocitoquímica de sinaptosomas y células neuronales, la conclusión del trabajo es que la pro-PC1 una vez que ingresa al retículo endoplásmico produce dos tipos de moléculas: una soluble y otras que presentan un comportamiento bioquímico de proteínas transmembranales. Estas proteínas pueden seguir dos vías a partir del TGN, la vía regulada, incorporándose a gránulos secretorios, y la vía constitutiva cuyo destino final es la membrana plasmática de sinaptosomas y de una línea celular neuronal. Esto nos sugiere que la enzima PC1 podría tener varias funciones dependiendo de su distribución subcelular, procesamiento autocatalítico y cambios post-traduccionales.