Busqueda del degradosoma de RNA de Bacillus subtillis
Date
2002
Authors
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
La estabilidad del RNA mensajero (mRNA) es un medio importante por el cual la expresión del gen es controlada. Muchos de los trabajos sobre el recambio del mRNA en bacterias se ha hecho en Escherichia coli, y poco es conocido acerca de su degradación en B. subtilis (Vázquez-Cruz y Olmedo-Alvarez, 1997). Se han hecho importantes avances en los pasados 10 años con la caracterización de elementos en el RNA que actúan en cis y de proteinas celulares que actúan en trans para el control del decaimiento del mRNA. En E. coli se han descrito principalmente cuatro ribonucleasas: dos endonucleasas (RNasa E y RNasa III) y dos exonucleasas (polinucleótido fosforilasa o PNPasa y RNasa II) con actividad 3'->5". Adicionalmente se ha descrito la participación de la poli(A) polimerasa (Grunberg-Manago, 1999). La RNasa E y la PNPasa se encuentran en un complejo multienzimático llamado degradosoma. En este complejo se incluye a la RNasa E, PNPasa, una helicasa dependiente de ATP (RhIB) miembro de la familia DEAD, y la enolasa, que es una enzima glicolitica (Py y cols., 1994). También hay proteínas adicionales asociadas a este complejo como proteinas de choque térmico, las chaperonas GroEL y Dnak, y la polifosfato cinasa, cuyo papel dentro del degradosoma es desconocido. En un estudio hecho en B. subtilis por Bechhofer en 1998 se reportó el primer análisis de la deleción en el gen pnp, que codifica para la PNPasa, indicando que la degradación del mRNA no fue severamente afectada a pesar de que en otros reportes se aseveró que la PNPasa es la principal exoribonucleasa 3'- >5' (Bechhofer y Wang, 1998). En B. subtilis no se conoce un homólogo la RNasa E de E. coli, que además de ser la principal endoribonucleasa, es la proteína que ancia al resto de proteínas del degradosoma. De igual forma, no se conocen otras exonucleasas similares a las más importantes en E. coli. Debido a que hay poca información acerca de los mecanismos coordinados de degradación del RNA en B. subtilis, en principio es necesario identificar los genes de las proteinas que posiblemente participen en la degradación del mRNA, con el fin de tratar de esclarecer si en B. subtilis existe un degradosoma de mRNA similar al de E. coli. Por medio de PCR amplificamos las secuencias de los genes pnp y yqfr que codifican respectivamente para las proteínas PNPasa y la helicasa YqfR de B. subtilis. Esta última es homóloga a la helicasa RhiB de E. Coli (34% de identidad). Las secuencias se clonaron en el vector de expresión pTrcHisA. Ambas secuencias expresaron péptidos de 84 kDa para la proteína PNPasa y de 49.8 kDa para la proteína YqfR. Se secuenció la parte N- terminal de cada una de las proteínas y las secuencias obtenidas de las dos proteínas fueron idénticas a las reportadas en el banco de genes. Purificamos a las 2 proteínas por cromatografía en columnas de níquel y se analizó la interacción de estas proteínas con extractos de B. subtilis crecidos a 30 y 37°C y también bajo un gradiente de glicerol del 10, 20 y 30%. En el análisis de interacción de proteínas PNPasa y YqfR hecho en este trabajo bajo ninguna condición se observó la presencia de alguna otra proteína asociada. De acuerdo con nuestros resultados es posible no exista el degradosoma en B. subtilis como el descrito en E. coli.