Identificación del orf parcial putativo de una AAT1 a partir de la mutante cysK de Azospirillum brasilense
Date
2005
Authors
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
Azospirillum es una bacteria de vida libre que fija nitrógeno, promotora del crecimiento vegetal, que se ha aislado de una amplia variedad de plantas de interés agronómico cereales y pastos forrajeros. Cuando el microorganismo se inocula en una planta hospedera estimula el desarrollo del sistema radical de la planta, aumentando la captación de nutrimentos. Este efecto benéfico se ha relacionado con la producción y excreción, por el microorganismo, de sustancias que regulan el desarrollo vegetal o fitoreguladores como las auxinas, giberelinas y citocininas. Se propone que la producción de la auxina ácido indol-3-acético (AIA) es el responsable de los efectos observados sobre el sistema radical
A pesar del esfuerzo realizado por varios investigadores para determinar si el AIΑ es el principal factor que promueve el efecto benéfico que aporta Azospirillum a la planta este esfuerzo es aún escaso, debido a que no se cuenta con mutantes totalmente deficientes en la producción de esta auxina. En este contexto es relevante caracterizar los genes involucrados en las vías de síntesis del AIA. La identificación del gen codificante de la aromático aminotransferasa (AATI), enzima que participa en la conversión de triptófano a ácido indol-3-pirúvico(IPyA), dentro de la vía del IPyA para la síntesis de AIA
En estudios previos dónde se purificó la AATI, se observó que esta enzima copurificó con una cisteína sintasa codificada por el gene cysk, ya que la estrategia de trabajo a seguir en este estudio requería de la purificación de la AATI se procedió a obtener una mutante cysk, por reemplazo alélico Una vez obtenida la mutante se caracterizó fisica y fenotipicamente, de manera interesante no presentó auxotrofia al aminoácido cisteína, lo que sugiere que presenta redundancia de genes y/o diversas vías para la síntesis de cisteína. Se observó que la mutante ostenta una disminución en su resistencia a telurito de potasio (compuesto muy tóxico en bacterias) de ocho veces, lo que confirma la participación del metabolismo de la cisteína en la resistencia al telurito observada en otras bacterias, la mutación se complementó con un cósmido de la genoteca de A. brasilense Sp7.
A partir de A. brasilense cysk, se purificó parcialmente la AATI, obteniéndose la enzima en mayor proporción, la cual se hidrolizó y nos permitió contar con la secuencia de dos péptidos del amino terminal uno de ellos exhibió identidad del 90% con una hitidil fosfato aromático aminotransferasa de Magnetospirillum magnetotacticum dato obtenido por el algoritmo BlastP utilizando el software DNAstar y el banco de datos Genebank, a partir de este péptido y la región conservada de unión al fosfato de piridoxal se procedió al diseño de oligonucleótidos degenerados para la amplificación por PCR a partir de DNA genómico de A. brasilense Sp7 Se obtuvo un amplificado con la longitud correspondiente a lo esperado, el cual fue clonado.