Producción de forma enzimática activa e inmunogénica del ectodominio de la hemaglutinina neuraminidasa (eHN) del rubulavirus porcino en la levadura pichia pastoris
Date
2016-04
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
"La enfermedad del ojo azul (EOA) de los cerdos, es una enfermedad viral endémica en México, se detectó en La Piedad, Michoacán hacia el año 1980, propagándose rápidamente hacia otros estados del Bajío Mexicano. Se caracteriza por producir signos neurológicos, respiratorios, falla reproductiva, mortalidad en lechones y por el desarrollo de una opacidad azul en la córnea en un bajo porcentaje de animales infectados. El agente etiológico es un paramixovirus llamado inicialmente virus de La Piedad Michoacán y clasificado posteriormente como Rubulavirus porcino (PorPV-LPMV), el cual muestra en su envoltura la glicoproteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN), presenta actividad hemaglutinante y neuraminidasa, además de ser la más inmunogénica y un objetivo importante para el desarrollo de vacunas. Diversos estudios señalan al ectodominio de la proteína (eHN) como la región que posee todos los epítopos inmunogenicos, los sitios de glicosilación y el sitio activo. Por ello, en este estudio se describe por primera vez, la obtención del ectodominio de la HN del PorPV a través del sistema de expresión de Pichia pastoris, debido a la capacidad de la levadura de llevar a cabo modificaciones postraduccionales en las proteínas, la seguridad que ofrece por su ausencia de toxinas, oncogenes y la simplicidad de los cultivos. Se amplificó por PCR el marco de lectura del gen del eHN de la cepa de PAC1, posteriormente fue subclonado en el vector de expresión (pPICZαB-eHN), el cual fue corroborado por patrones de restricción y secuenciación, posteriormente se integró a la región promotora de AOX1 por desplazamiento en el cromosoma de la levadura, dando como resultado un fenotipo Mut+, el cual se determinó mediante PCR y crecimiento en medio diferencial con metanol (MMH). La cepa resultante fue denominada X33-eHN62-576, la cual fue llevada a expresión utilizando como fuente de carbono metanol e induciendo la expresión a altas densidades celulares con 8 días de alimentación con metanol. El eHN expresado en la cepa de P. pastoris X33 se recuperó en forma soluble a partir de medio libre de células, observándose hasta 67 nmol/min/mg de actividad neuraminidasa después de 6 días de expresión. Con la representación de Lineweaver-Burk se determinaron los parámetros cinéticos del eHN, se obtuvo un valor de Vmáx de 227.3 nmol/min/mg y una Km de 2.86 mg/ml. El eHN fue reconocido en western blot y ELISA por el suero de cerdos infectados con PorPV perteneciente a cepas que circulan actualmente en granjas persistentemente infectadas en la región del Bajío Mexicano. La proteína recombinante se purificó en un solo paso mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados con un rendimiento del 92%, recuperándose 1.2 mg de proteína pura por cada l de cultivo. El eHN induce la producción de anticuerpos en ratones de la cepa CD-1 después de inmunizar por 28 días con reconocimiento específico en la prueba de ELISA. Estos anticuerpos fueron capaces de inhibir la replicación del virus en más del 80% en ensayos de sero-neutralización viral en cultivo celular. Estos estudios demuestran la obtención de una proteína (eHN) con características similares a la HN nativa y que puede ser un buen candidato para proponer una vacuna o utilizar el antígeno en una prueba de diagnóstico serológico."