Caracterización y clonación del gen CysK que codifica para la enzima cisteína sintasa en Azospirillum brasilense Sp7
Date
2004
Authors
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
El género Azospirillum (subclase a de las proteobacterias), pertenece al grupo de las denominadas bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), ya que estimulan el desarrollo de las plantas que colonizan. Se considera que esta asociación es una "simbiosis asociativa" por no tratarse de una verdadera simbiosis mutualista, ya que induce cambios morfológicos y fisiológicos en las raíces de las plantas debido a la producción de hormonas de crecimiento, provocando un aumento en la toma de agua y minerales lo cual sumado a la fijación biológica de nitrógeno atmosférico pueden promover el crecimiento y rendimiento de los cultivos.
La cisteína es un aminoácido esencial, único con la capacidad de formar enlaces disulfuro, funcionalmente muy importante en la estructura, estabilidad y como centro catalítico de muchas proteínas en todas las formas vida. La cisteína es también la mayor fuente de azufre, para compuestos que lo contienen, tanto en procariontes como en eucariontes. En bacterias, la cisteína es sintetizada a partir de serina, por la incorporación de azufre o tiosulfato. En el primer paso, la O-acetilserina es formada por la serina transacetilasa, producto del gen cysE; la cisteína es el producto del segundo paso de la reacción catalizada por la enzima O- acetilserina(tiol)-liasa A (en crecimiento aeróbico), u O-acetilserina(tiol)-liasa B (OASS) (en crecimiento anaeróbico), codificadas por los genes cysk y cysM, respectivamente.
En este trabajo se realizó la clonación y secuenciación del gen cysk que codifica para O- acetilserina(tiol)-liasa A, de Azospirillum brasilense Sp7, se diseñaron iniciadores en base a la secuencia de los péptidos de la proteína purificada en un trabajo previo con los que mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se logró la amplificación de un fragmento 912 pb, cuya secuencia muestra un alto porcentaje de identidad con los genes cysk reportados de Brucella melitensis (75.5%), Sinorhizobium meliloti (66.5%), Rhodospirillum rubrum (65.3%), entre otros.
Al hibridar con el DNA genómico total de A. brasilense Sp7 digerido con Sal 1, contra la región carboxilo terminal del gen cysk como sonda, se identificaron tres bandas, mientras que la hibridación con el amplificado de 912pb, muestra sólo una banda; lo que sugiere la presencia del gen cysM. Para respaldar esta hipótesis, se realizó la mutación del gen cysk de A. brasilense Sp7, dicha mutante no muestra auxotrofia a cisteína (Ramirez Mata, datos no publicados)
Mediante los ensayos de complementación de la cepa de E. coli NK3 auxótrofa de cisteína (cysk, cysM), con el amplificado de 912 pb clonado en vector de expresión pBAD-TOPO, se probó la funcionalidad del gen cysk de A. brasilense Sp7.