Patrones de expresion de la caña de azucar cuando es colonizada por Gluconacetobacter diazotrophicus
Date
2001
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
En las interacciones planta-microorganismo se conoce muy poco acerca de los genes que expresa la planta y mucho menos en la interacción G. diazotrophicus y la caña de azúcar. Así que realizamos una búsqueda de patrones de expresión diferencial cuando la caña de azúcar es colonizada por G. diazotrophicus. Este endofito se transmite de generación en generación en la planta por la propagación vegetativa de la caña de azúcar, por esto era necesario obtener plántulas axénicas y para evitar variaciones somaclonales se utilizó el cultivo de meristemos apicales de las variedades MEX 57- 473 y MY 55-14 con la subsecuente obtención de brotes. Las plántulas axénicas solo se obtuvieron de la variedad MEX 57-473, obteniendo mejores rendimientos que los reportados. Las plántulas axénicas fueron inoculadas con G. diazotrophicus en condiciones deficientes de fuente de carbono (para la bacteria) y de fuente de nitrógeno (asimilable para la planta). La primera cinética de infección se realizó de 1 a 15 dias, se analizaron muestras de 1, 5, 10 y 15 días de post-infección, se observó que la colonización se llevo a cabo conforme a lo ya reportado. La segunda cinética de infección fue de 24 horas, analizando muestras a las 4, 8, 12 y 24 horas post-infección, se extrajeron los ARN totales de estos tiempos para utilizarlos en el método de cDNA AFLP. El método para el estudio del transcriptoma de la caña de azúcar fue el cDNA AFLP, porque este es recomendado para genomas complejos, un método reproducible y relativamente sencillo para este tipo de estudios. Nosotros utilizamos enzimas de restricción diferentes a las reportadas por otros autores, las cuales se eligieron analizando que enzimas de restricción digerian los ADNc reportados, buscamos enzimas de corte cohesivo que reconocian 4 pares de bases (enzima de corte frecuente) y enzimas que reconocen 6 pares de bases (enzima de corte raro), elegimos Taq 1 y Bgl II, porque el 21% de los ADNc analizados eran cortados por ambas enzimas generando fragmentos de 100 a 500 pb, un extremo se generó por Taq I (enzima de corte raro) y el otro extremo por Bgl II (enzima de corte frecuente). Nosotros estandarizamos el método de cDNA AFLP para la caña de azúcar cuando es inoculada con G. diazotrophicus a las 4, 8, 12 y 24 horas post-infección, los patrones de expresión diferencial se analizaron en el ABI-Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) utilizando oligonucleotidos iniciadores de amplificación selectiva de Bgl II marcados con fluorocromo, esto permitió visualizar con que combinaciones de bases extras en las amplificaciones selectivas obtenemos productos de expresión diferencial Los patrones mostraron que habia productos que aumentaba su expresión conforme pasaba el tiempo y otros productos tenían máximos de expresión a las 4 u 8 horas posteriores a la infección. La caña de azúcar posee un genoma complejo, por esta razón esperamos una gran cantidad de bandas en las amplificaciones selectivas, pero no fue asi, se obtuvieron un número reducido de bandas desde que se utilizó una base extra en las amplificaciones selectivas.