Análisis genético de elementos reguladores y estruscturales en la función del regulador transcripcional PerA en Escherichia coli enteropatógena
Date
2004
Authors
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
En Escherichia coli enteropatógena (EPEC), los promotores de bfpA y perA son activados por la proteina PerA, un activador transcripcional perteneciente a la familia de los reguladores AraC/XyIS, lo cual sugiere la presencia de secuencias comunes en sus regiones reguladoras.
Para caracterizar con mayor detalle las secuencias que controlan la expresión de los operones bfp y per, las regiones reguladoras de ambos operones se hicieron similares por medio de remociones en la región reguladora de bfpA e inserciones en la región reguladora de perA. La expresión de fusiones transcripcionales que contienen remociones de 10, 20 y 102 pb proximales y 11 pb. distales al presunto promotor de bfpA se ve drásticamente afectada, lo cual sugiere que la secuencia comprendida entre la posición-35 a -55 es necesaria para la activación dependiente de PerA. En ensayos de cambio de movilidad electroforética se observó que la interacción Popa-Pera se vio afectada con la remoción de 11 pb distales, pero no con las remociones de 10 y 20 nucleótidos.
Para el caso de la región reguladora de perA se realizó una inserción de 19 pb idénticas a las que tiene la región reguladora de bfpA la cual afectó drásticamente la expresión de la fusión transcripcional perA-cat, sin embargo en los ensayos tipo EMSA se observó interacción Ppera-PerA similar a la que ocurre con la región reguladora silvestre. Estos datos sugieren que el regulador PerA puede interaccionar con sus sitios de unión independiente de la distancia con el promotor pero dependiente de su orientación. Sin embargo, los datos también sugieren que la activación si es dependiente de dichas distancias por los posibles contactos con la RNA polimerasa.
Para el análisis de elementos estructurales en la proteina PerA involucrados en la interacción con su DNA blanco, se diseño la mutagénesis de aminoácidos conservados del dominio HTH-2. La mutante PerAl232A-L238F, que presenta un doble cambio de aminoácidos Ile232 por Ala y Leu238 por Phe, tiene un efecto perjudicial sobre la expresión de las fusiones bfpA-cat y perA-cat, ya que fue incapaz de activarlas, indicando que aminoácidos conservados en el dominio HTH- 2, pudieran estar involucrados en las interacciones con el DNA y/o la activación de sus genes blanco.