Aislamiento y caracterizacion de cepas de Acetobacter diatrophicus de caña de azucar: Purificacion parcial de la nitrogenasa de A.diazotrophicus
Date
1998
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
Las primeras observaciones sobre interacciones de microorganismos que fijan nitrógeno con plantas no leguminosas, se evidenciaron cuando se aisló Beijerinckia spp en la rizosfera de la caña de azúcar y a Azotobacter paspalii en asociación con Paspalum notatum, (Döbereiner 1961). Una considerable actividad de nitrogenasa, asociada con las raíces de caña de azúcar fue detectada por diferentes autores usando el ensayo de reducción de acetileno (ARA) (Döbereiner et al 1972, Purchase 1980). El primer intento para cuantificar la contribución de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) a las plantas fue realizado por Ruschel et al (1975) quienes reportaron una clara incorporación de N15 gaseoso en plantas intactas de 90 días de crecimiento. Sin embargo, sólo hasta que se usaron las técnicas de balance de nitrógeno y dilución de N15, pudo evaluarse la contribución de la FBN en el ciclo de desarrollo de esta planta (Lima et al 1987, Urquiaga et al 1992). Aún antes de que datos exactos cuantificaran la contribución de la FBN en el desarrollo de la caña de azúcar, muchas géneros de bacterias fijadoras de nitrógeno se habían aislado de la rizosfera, raíz, tallos y algunas hojas de la caña de azúcar, dentro de éstas podemos mencionar Beijerinckia, Azospirillum, Azotobacter, Erwinia, Derxia y Enterobacter spp, (Purchase 1980, Dobereiner 1961)) Recientemente se ha aislado una nueva especie de bacteria fijadora de nitrógeno Acetobacter diazotrophicus, que se presenta en gran cantidad en las raíces y tallos de la caña de azúcar (Cavalcante & Döbereiner 1988, Gillis et al 1989). Este diazótrofo, originalmente aislado en medios semisólidos con jugo de caña de azúcar, es un bacilo aerobio Gram negativo, que se desarrolla formando una película en medios semisólidos libres de nitrógeno con 10% de sacarosa, después de 7 a 10 días de desarrollo forma una película delgada en la superficie, este desarrollo mejora cuando la concentración de glucosa y sacarosa es alta (10%). La producción de ácido provoca una disminución del pH hasta 3 o menos, pero su crecimiento y la fijación de nitrógeno continua a este pH por varios días, (Stephan et al 1991). Esta bacteria no posee nitrato reductasa lo cual le permite desarrollarse a altas concentraciones de nitrato, el amonio causa sólo la inhibición parcial de la actividad de la nitrogenasa, especialmente cuando la bacteria se desarrolla en 10% de sacarosa (Texeira et al 1987, Boddey et al 1991), también muestra una alta tolerancia al oxígeno en vida libre, (Reiss et al 1990). La bacteria se ha aislado de muchas variedades de caña de azúcar en diferentes regiones de Brasil, Cuba, Australia y México, (Fuentes Ramírez et al 1992, Li & Macrae 1991). La FBN en todos los microorganismos diazótrofos está mediada por el sistema enzimático de las nitrogenasas, éstas no muestran diferencias importantes cuando se aislan y purifican. Los mecanismos por los cuales se protege este sistema enzimático de la acción del oxígeno, marcan la diferencia de un microorganismo diazótrofo a otro. Las características particulares de la FBN en A. diazotrophicus como son: un metabolismo oxidativo activo, tolerancia de los microorganismos intactos a altas tensiones de oxígeno y continuar la fijación de nitrógeno aún a pH de 2.5 hacen interesante el estudio de la nitrogenasa de este microorganismo y de los mecanismos por los cuales este proceso es resistente a las altas tensiones de oxígeno y los bajos pHs. En el presente trabajo, logramos aislar nueve cepas de A. diazotrophicus a partir de 150 muestras de diferentes cultivos, 135 fueron de caña de azúcar, 12 de maíz y 3 de pasto forrajero. Las nueve cepas fueron aisladas de caña de azúcar, una se aisló de raíz principal y ocho del tallo; éstas se caracterizaron por métodos microscópicos, tintoriales, bioquímicos y fisiológicos, asimismo, se determinó su capacidad de fijación de nitrógeno en presencia y ausencia de nitrato. Lo anterior se realizó con la finalidad de seleccionar, una cepa nativa que fuera buena fijadora de nitrógeno, comparando la actividad específica de nitrogenasa de las cepas nativas y tipo. Se eligió a la cepa tipo PAL5. Esta cepa se eligió debido a que: fue la cepa que mostró mayor actividad específica de enzima en comparación con otras cepas tipo y con las cepas nativas. Con Acetobacter diazotrophicus PAL 5 se realizaron ensayos para determinar las condiciones óptimas de cultivo masivo en un fermentador. Una vez obtenido el cultivo masivo se lisaron las células y se determinaron las condiciones óptimas para la actividad de nitrogenasa en un extracto crudo; a partir de este extracto se realizó la purificación parcial de la enzima, por medio de cromatografía en columna de intercambio iónico, se detectó la presencia de la enzima en las fracciones por medio de anticuerpos policlonales anti Avl y Av2, utilizando la técnica de inmunoelectrotransferencia y por la técnica de ARA. Lográndose detectar una de las fracciones de la enzima. Por último se determinó la actividad de la enzima en cultivos que se desarrollaron en diferentes tensiones de oxígeno, la detección se realizó utilizando las dos técnicas antes mencionadas. Detectando que la enzima presentaba mayor actividad a tensión de oxígeno de un 4% v/v y posteriormente decaía su actividad, lo que concuerda con el comportamiento de otras nitrogenasas que se han purificado de microorganismos aerobios, por la técnica de inmunoelectrotransferencia se logró detectar que a mayor porcentaje de oxígeno en el medio, aumentaba la cantidad de una de las fracciones.