Clonación y secuenciación de componentes de un presunto transportador para el fierro, tipo ABC de Gluconacetobacter diazotrophicus
Date
2003
Authors
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Publisher
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Abstract
En la búsqueda de genes que codifican para el complejo oxidasa terminal a, de Gluconacetobacter diazotrophicus, se realizó un escrutinio de un minibanco construido en el plásmido pSUP202 donde, se clonaron fragmentos del genoma de G. diazotrophicus obtenidos por digestión con EcoRI; empleando como sonda una región de 400 pb obtenida por reacción de PCR; de este estudio se obtuvieron dos clonas, se procedió a la purificación de estos dos plásmidos recombinantes, los cuales contienen insertos de una longitud de 5.4 y 3.1 Kb (nombrados pAD001 y pAD002, respectivamente).
La determinación del mapa de restricción de pAD001 indicó la presencia de sitios de restricción, que sirvieron para subclonar y obtener los plásmidos pAD191 y pAD131, de 1.9 kb y 1.3 kb respectivamente. Se determinó la secuencia de nucleótidos de ambos plásmidos. El análisis de la secuencia de pAD191 mostró dos fases de lectura abierta, denominados ORF1 (192 aminoácidos) y ORF2 (secuencia parcial de 64 aminoácidos). El análisis BLASTP indicó la siguiente homología: identidad de 41% y 54% de similitud del ORF 1 con una PBP (por sus siglas en inglés, Periplasmic binding protein); e identidad de 55% y 75% de similitud para el ORF 2 con una proteína integral de membrana, denominada dominio transmembranal TMD; cuyos productos de traducción indican la presencia de presuntas proteínas componentes de un sistema putativo de transporte de hierro (Fe) tipo ABC. Aunque los porcentajes identidad/similitud del ORF 1 son significativos, solo se obtuvo una secuencia parcial (correspondiente al presunto extremo carboxilo terminal ), por lo que estudios adicionales son requeridos. La homología más significativa del ORF2 concierne a una proteína de Zymomonas mobilis. Alineamientos adicionales tipo CLUSTALW indicaron que, aunque en menor grado esta presunta proteína también muestra homología significativa con otras proteínas integrales de membrana y componentes de un sistema de transporte para el Fe, de otras bacterias.
La secuencia obtenida de pAD131 mostró también dos fases de lectura abierta (ORF2 con 279 aminoácidos y ORF3 con 285 aminoácidos); mediante el análisis BLASTP se identificó homología (identidad 44% y similitud 61%) del ORF 2 con el extremo carboxilo terminal de la proteína integral de membrana putativa de Z. mobilis, cuya región amino terminal se encuentra contenida en el ORF2 de pAD191. El ORF2 está constituido de 343 aminoácidos, con un peso molecular de 34,417 Da y un pl teórico de 9.2. La ORF3 reveló una identidad de 55% y similitud de 68% con el componente de unión a ATP, los cuatro motivos característicos de estas proteínas fueron localizados en la secuencia, que contiene 286 amino ácidos y un peso molecular estimado de 30,318 Da y un pl teórico de 11.3. En el presente estudio se identificaron 3 fases de lectura abierta (ORFs) que presuntamente codifiquen para componentes de un sistema de transporte tipo ABC para Fe en G. diazotrophicus. Los datos obtenidos indican que en el plásmido pAD001 ocurren genes ortólogos de un sistema de transporte tipo ABC para Fe descritos en Escherichia coli, Haemophilus influenzae, y la cianobacteria Synechocystis sp, cuya organización es sugerente de un operón.
Con el fin de iniciar la caracterización de este sistema de transporte tipo ABC se obtuvo una mutante por reemplazo alélico con un cartucho de resistencia al antibiótico kanamicina, la mutante se analizó por hibridación DNA/DNA y amplificación, para corroborar la inserción del cartucho.