Teis de Maestría

Permanent URI for this collection

https://hdl.handle.net/20.500.12371/21039

Browse

Now showing 1 - 20 of 41

Aislamiento y caracterizacion de cepas de Acetobacter diatrophicus de caña de azucar: Purificacion parcial de la nitrogenasa de A.diazotrophicus
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 1998) Pardo Ruiz, Maria Augusta Patricia; Eugenia Baca, Beatriz
Las primeras observaciones sobre interacciones de microorganismos que fijan nitrógeno con plantas no leguminosas, se evidenciaron cuando se aisló Beijerinckia spp en la rizosfera de la caña de azúcar y a Azotobacter paspalii en asociación con Paspalum notatum, (Döbereiner 1961). Una considerable actividad de nitrogenasa, asociada con las raíces de caña de azúcar fue detectada por diferentes autores usando el ensayo de reducción de acetileno (ARA) (Döbereiner et al 1972, Purchase 1980). El primer intento para cuantificar la contribución de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) a las plantas fue realizado por Ruschel et al (1975) quienes reportaron una clara incorporación de N15 gaseoso en plantas intactas de 90 días de crecimiento. Sin embargo, sólo hasta que se usaron las técnicas de balance de nitrógeno y dilución de N15, pudo evaluarse la contribución de la FBN en el ciclo de desarrollo de esta planta (Lima et al 1987, Urquiaga et al 1992). Aún antes de que datos exactos cuantificaran la contribución de la FBN en el desarrollo de la caña de azúcar, muchas géneros de bacterias fijadoras de nitrógeno se habían aislado de la rizosfera, raíz, tallos y algunas hojas de la caña de azúcar, dentro de éstas podemos mencionar Beijerinckia, Azospirillum, Azotobacter, Erwinia, Derxia y Enterobacter spp, (Purchase 1980, Dobereiner 1961)) Recientemente se ha aislado una nueva especie de bacteria fijadora de nitrógeno Acetobacter diazotrophicus, que se presenta en gran cantidad en las raíces y tallos de la caña de azúcar (Cavalcante & Döbereiner 1988, Gillis et al 1989). Este diazótrofo, originalmente aislado en medios semisólidos con jugo de caña de azúcar, es un bacilo aerobio Gram negativo, que se desarrolla formando una película en medios semisólidos libres de nitrógeno con 10% de sacarosa, después de 7 a 10 días de desarrollo forma una película delgada en la superficie, este desarrollo mejora cuando la concentración de glucosa y sacarosa es alta (10%). La producción de ácido provoca una disminución del pH hasta 3 o menos, pero su crecimiento y la fijación de nitrógeno continua a este pH por varios días, (Stephan et al 1991). Esta bacteria no posee nitrato reductasa lo cual le permite desarrollarse a altas concentraciones de nitrato, el amonio causa sólo la inhibición parcial de la actividad de la nitrogenasa, especialmente cuando la bacteria se desarrolla en 10% de sacarosa (Texeira et al 1987, Boddey et al 1991), también muestra una alta tolerancia al oxígeno en vida libre, (Reiss et al 1990). La bacteria se ha aislado de muchas variedades de caña de azúcar en diferentes regiones de Brasil, Cuba, Australia y México, (Fuentes Ramírez et al 1992, Li & Macrae 1991). La FBN en todos los microorganismos diazótrofos está mediada por el sistema enzimático de las nitrogenasas, éstas no muestran diferencias importantes cuando se aislan y purifican. Los mecanismos por los cuales se protege este sistema enzimático de la acción del oxígeno, marcan la diferencia de un microorganismo diazótrofo a otro. Las características particulares de la FBN en A. diazotrophicus como son: un metabolismo oxidativo activo, tolerancia de los microorganismos intactos a altas tensiones de oxígeno y continuar la fijación de nitrógeno aún a pH de 2.5 hacen interesante el estudio de la nitrogenasa de este microorganismo y de los mecanismos por los cuales este proceso es resistente a las altas tensiones de oxígeno y los bajos pHs. En el presente trabajo, logramos aislar nueve cepas de A. diazotrophicus a partir de 150 muestras de diferentes cultivos, 135 fueron de caña de azúcar, 12 de maíz y 3 de pasto forrajero. Las nueve cepas fueron aisladas de caña de azúcar, una se aisló de raíz principal y ocho del tallo; éstas se caracterizaron por métodos microscópicos, tintoriales, bioquímicos y fisiológicos, asimismo, se determinó su capacidad de fijación de nitrógeno en presencia y ausencia de nitrato. Lo anterior se realizó con la finalidad de seleccionar, una cepa nativa que fuera buena fijadora de nitrógeno, comparando la actividad específica de nitrogenasa de las cepas nativas y tipo. Se eligió a la cepa tipo PAL5. Esta cepa se eligió debido a que: fue la cepa que mostró mayor actividad específica de enzima en comparación con otras cepas tipo y con las cepas nativas. Con Acetobacter diazotrophicus PAL 5 se realizaron ensayos para determinar las condiciones óptimas de cultivo masivo en un fermentador. Una vez obtenido el cultivo masivo se lisaron las células y se determinaron las condiciones óptimas para la actividad de nitrogenasa en un extracto crudo; a partir de este extracto se realizó la purificación parcial de la enzima, por medio de cromatografía en columna de intercambio iónico, se detectó la presencia de la enzima en las fracciones por medio de anticuerpos policlonales anti Avl y Av2, utilizando la técnica de inmunoelectrotransferencia y por la técnica de ARA. Lográndose detectar una de las fracciones de la enzima. Por último se determinó la actividad de la enzima en cultivos que se desarrollaron en diferentes tensiones de oxígeno, la detección se realizó utilizando las dos técnicas antes mencionadas. Detectando que la enzima presentaba mayor actividad a tensión de oxígeno de un 4% v/v y posteriormente decaía su actividad, lo que concuerda con el comportamiento de otras nitrogenasas que se han purificado de microorganismos aerobios, por la técnica de inmunoelectrotransferencia se logró detectar que a mayor porcentaje de oxígeno en el medio, aumentaba la cantidad de una de las fracciones.
Aislamiento y caracterizacion parcial de cepas silvestres de Bacillus thuringiensis del estado de Puebla
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2002) Navez Gonzalez, Daysi; Vazquez Cruz, Candelario
Bacillus thuringiensis es una bacteria ampliamente distribuida en el medio ambiente, principalmente se encuentra en suelo. Por su actividad bioinsecticida ha sido utilizada para el control biológico de insectos. Produce una protoxina que se acumula en forma de cristal durante la esporulación que mata a insectos de diferentes órdenes en su estado larvario. En el presente trabajo se aislaron 500 cepas de B. thuringiensis de 149 muestras de suelo/humus de diferentes zonas del Estado de Puebla, México. Se observó que la forma predominante de los cristales de las cepas aisladas es redonda o esférica (98.6%), solo un aislado contiene un cristal en forma de barra. La detección de genes mosquitocidas por hibridación ADN-ADN mostró que el gen predominante es el gene cry44a (10.2%). Las cepas aisladas DNG93II, DNG941, DNG95 mostraron homologia con los genes cry4Aa, cry10Aa y cryllAa. Mediante PCR y con uso de oligonucleótidos específicos para estos genes se amplificaron fragmentos de 1579 pb para cry4Aa, 1290 pb para cry10Aa y 1422 pb para cryllAa, estos patrones de amplificación se esperarían en cepas con genotipo semejante a B. thuringiensis subsp israelensis (Bti), como ocurrió en los PCRs de estas tres cepas. También presentan patrones de proteinas muy similar al de B. thuringiensis subsp israelensis y tienen actividad tóxica en larvas de Culex quinquefasciatus y Aedes aegypti. Solo la cepa DNG102III mostró homología con los genes cry10Aa y cryllAa, y por PCR se amplificó un fragmento de 600 pb con oligonucleótidos para cry10Aa. Además, presentó un patrón de proteinas semejante a la de B. thuringiensis subsp jegathesans o B. thuringiensis subsp medellin las cuales son tóxicas a mosquitos. En este estudio encontramos que el 15% de las cepas aisladas presentan genes homólogos a los genes mosquitocidas y solo 0.8% tiene actividad tóxica.
Análisis de la variabilidad genotípica de Haemophilus influenzae tipificables y no tipificables
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Báez Morales, Alejandra; Rocha Gracia, Rosa del Carmen
Existen dos categorías entre las cepas de H. influenzae: H. influenzae tipificable, el cual provoca infecciones de tipo sistémico y H. influenzae no tipificable, que produce infecciones localizadas. La nasofaringe del tracto respiratorio es considerado el principal reservorio de este microorganismo. H. influenzae está sometido a una fuerte presión ambiental selectiva por parte del sistema inmune y tratamiento antimicrobiano, por lo que, para facilitar la evasión de la respuesta inmune generada por el hospedero humano, este microorganismo tiene mecanismos que han evolucionado y por los cuales, los antígenos sobre su superficie pueden sufrir variación antigénica o de fase. Además, a pesar de que con la introducción de la vacuna contra el antígeno capsular b ha disminuido la enfermedad drásticamente, en algunos países se ha reportado la reemergencia de enfermedades invasivas por H. influenzae en niños vacunados, así como casos de enfermedades invasivas por otros serotipos diferentes al b (a, e, f) o por cepas no tipificables. Debido a lo anterior, es necesario realizar estudios genotípicos y fenotípicos que conlleven a establecer medidas de vigilancia epidemiológica de acuerdo a la variedad de clonas bacterianas circulantes y su relación entre ellas. Por lo que en este trabajo se planteó el estudio genotípico de cepas de H. influenzae capsulados y no capsulados aisladas en la ciudad de Puebla en el periodo prevacunal 1990-1995, mediante la amplificación por PCR de las secuencias repetidas intergénicas de enterobacterias (PCR-ERIC), así como la caracterización fenotípica de las cepas realizando serotipificación, biotipificación, perfil de proteínas de membrana externa, sensibilidad antimicrobiana y producción de ẞ-lactamasas. Se estudiaron 140 cepas de H. influenzae (47 serotipo by 93 no tipificables), obteniéndose mediante la genotipificación 46 perfiles electroforéticos dentro de los cuales el 80% de H. influenzae tipo b presentaron un fragmento de 1.8 kbp y más del 60% de H. influenzae no tipificables un fragmento de 0.9 kbp, sugiriendo que estos fragmentos pudieran estar involucrados en la patogenia de la enfermedad. Después del análisis estadístico de los perfiles electroforéticos se obtuvieron dos grandes grupos (I y II); la mayoría de cepas de H. influenzae tipo b se ubicaron dentro del grupo I, presentando entre ellas una alta homogeneidad y por lo contrario las cepas de H. influenzae no tipificables se ubicaron en ambos grupos presentando una alta heterogeneidad. Los biotipos III y IV se presentaron en mayor frecuencia entre las cepas de H. influenzae de origen clínico y portador, lo biotipos I, II, III entre las cepas de H. influenzae no tipificables de portadores y los biotipos I y IV entre las cepas de H. influenzae no tipificables de origen clínico. Se obtuvieron proteínas de membrana externa de 22 a 110 kDa. En general la cepas de H. influenzae fueron resistentes a la Ampicilina y a la Tetraciclina. Las cepas de H. influenzae tipo b presentaron mayor producción de ẞ-lactamasas que las cepas de H. influenzae no tipificables
Analisis del papel de los flavonoides en la colinizacion de frijol por Gluconacetobacter diazotrophicus
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2001) Trujillo Lopez, Maria Alejandra; Cano Camacho, Horacio; Trujillo Lopez, Maria Alejandra
La colonización ha mostrado ser un factor importante en el establecimiento de la interacción entre bacterias potencialmente benéficas a plantas. Estudios recientes de bacterias diazotroficas dan importantes contribuciones a extender la FBN a otros tipos de cultivo diferentes a plantas leguminosas. Este tipo de interacciones se establecen en respuesta a múltiples señales reguladoras, de los cuales los flavonoides han mostrado ser señales comunes necesarias para el establecimiento de las interacciones planta- microorganismo. Los flavonoides son liberados por la raiz e influyen en la expresión de genes bacterianos, en la quimiotaxis, en la prevención de la distribución de patógenos, asi como, en la promoción de la colonización. Dado a que nosotros estamos interesados en identificar factores potenciales involucrados en la interacción primaria planta diazótrofo, analizamos la capacidad de Gluconacetobacter diazotrophicus (un endófito de caña de azúcar) a responder a estos metabolitos. Para asegurar la posibilidad de que G diazotrophicus pudiera responder a estos químicos producidos por las raices, nosotros inducimos la producción de flavonoides en las plántulas de frijol común por estrés con luz UV, e infectamos con el diazótrofo. En este trabajo, nosotros reportamos cambios cualitativos y cuantitativos en la adherencia de la bacteria a las raíces de las plántulas tratadas con luz UV, también mostramos resultados de al menos 1 compuesto flavonoide, aislado de las raíces de plántulas de frijol irradiadas con luz UV con un efecto positivo sobre la colonización, además del papel de flavonoides estándares naringenina y daidzeina como inductores de la colonización en este sistema de estudio.
Análisis genético de elementos reguladores y estruscturales en la función del regulador transcripcional PerA en Escherichia coli enteropatógena
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Tejeda Leon, Alma; Puente García, Jose Luis; Martínez Laguna, Ygnacio/Arenas Hernández Margarita, Ma. De la Paz/Vázquez Cruz, Candelario/Castañeda Lucio, Miguel; Martínez Laguna, Ygnacio
En Escherichia coli enteropatógena (EPEC), los promotores de bfpA y perA son activados por la proteina PerA, un activador transcripcional perteneciente a la familia de los reguladores AraC/XyIS, lo cual sugiere la presencia de secuencias comunes en sus regiones reguladoras. Para caracterizar con mayor detalle las secuencias que controlan la expresión de los operones bfp y per, las regiones reguladoras de ambos operones se hicieron similares por medio de remociones en la región reguladora de bfpA e inserciones en la región reguladora de perA. La expresión de fusiones transcripcionales que contienen remociones de 10, 20 y 102 pb proximales y 11 pb. distales al presunto promotor de bfpA se ve drásticamente afectada, lo cual sugiere que la secuencia comprendida entre la posición-35 a -55 es necesaria para la activación dependiente de PerA. En ensayos de cambio de movilidad electroforética se observó que la interacción Popa-Pera se vio afectada con la remoción de 11 pb distales, pero no con las remociones de 10 y 20 nucleótidos. Para el caso de la región reguladora de perA se realizó una inserción de 19 pb idénticas a las que tiene la región reguladora de bfpA la cual afectó drásticamente la expresión de la fusión transcripcional perA-cat, sin embargo en los ensayos tipo EMSA se observó interacción Ppera-PerA similar a la que ocurre con la región reguladora silvestre. Estos datos sugieren que el regulador PerA puede interaccionar con sus sitios de unión independiente de la distancia con el promotor pero dependiente de su orientación. Sin embargo, los datos también sugieren que la activación si es dependiente de dichas distancias por los posibles contactos con la RNA polimerasa. Para el análisis de elementos estructurales en la proteina PerA involucrados en la interacción con su DNA blanco, se diseño la mutagénesis de aminoácidos conservados del dominio HTH-2. La mutante PerAl232A-L238F, que presenta un doble cambio de aminoácidos Ile232 por Ala y Leu238 por Phe, tiene un efecto perjudicial sobre la expresión de las fusiones bfpA-cat y perA-cat, ya que fue incapaz de activarlas, indicando que aminoácidos conservados en el dominio HTH- 2, pudieran estar involucrados en las interacciones con el DNA y/o la activación de sus genes blanco.
Análisis genético de PerA (BfpT), el regulador transcripcional de los operones bfp y per en Escherichia coli enteropatogena
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2003) Tecpanecatl Xihuitl, José Sergio; Martínez Laguna, Ygnacio; Puente García, José Luis
En Escherichia coli enteropatógena la producción del pilus BFP es dependiente del regulador PerA (BfpT), un activador transcripcional de la familia AraC/XylS. PerA es una proteína de 274 aminoácidos cuyo extremo carboxilo (trecho de 99 aminoácidos), contiene dos dominios a-hélice-vuelta-a-hélice (HTH) similares a los dominios de unión a DNA de algunas proteínas reguladoras. En este estudio se generaron mutantes de PerA (BfpT) en aminoácidos del dominio HTH-2 y fueron analizadas en su capacidad para activar la expresión de fusiones transcripcionales y de unión a DNA. Dos de las mutaciones fueron dirigidas a los residuos Tirosina 255 y Prolina 259 (mutantes PerA-Y255A y PerA-P259A), las cuales afectaron drásticamente la capacidad de PerA de activar la expresión de las fusiones transcripcionales bfpA-cat y perA-cat. Adicionalmente, se obtuvo la mutante PerA-K260Ocre en la cual se introdujo un codón de paro en la posición 260 y una doble mutante con cambios en los residuos Lisina 249 y Tirosina 255. En ambos casos se observó un efecto similar a las mutantes anteriores, remarcando la importancia de estos aminoácidos en la capacidad de PerA de activar a los promotores Ppert y Pbfpt. Posteriormente, las proteínas mutantes PerA-Y255A y PerA-P259A fueron purificadas como proteínas de fusión a MBP y utilizadas en experimentos de interacción proteína-DNA. Nuestros datos indican que el dominio HTH-2 está involucrado en el reconocimiento y la unión a las secuencias reguladoras de los genes blanco, lo cual es concordante con lo determinado para otras proteínas de la misma familia.
Búsqueda de los productos de expresión de la helicasa tipo RecQ de región subtelomérica en Ustilago maydis
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2003) Vaquero Vera, Araceli; Sánchez Alonso, Patricia G.
Las helicasas RecQ presentan actividad de desenrollamiento de DNA doble en una dirección 3'-5', su actividad catalítica es dependiente de la presencia de ATP, de la concentración de iones Mg+2 y es estimulada por las proteínas de unión a DNA de cadena sencilla (SSB). En diversos organismos, desde bacterias a humanos, se han descrito helicasas homólogas a RecQ, las cuales de manera general participan en recombinación homóloga, (relacionándolas así en procesos de reparación de ruptura de doble cadena), así como en la supresión de recombinación ilegítima. Además recientemente se ha descrito que son capaces de desenrollar estructuras estabilizadas por cuartetos de guanina (4G), involucrándose en la resolución de estructuras aberrantes formadas durante el proceso de replicación. Debido a la homología que presentan y a sus características funcionales semejantes, se conformó una subfamilia denominada Helicasas RecQ. En Ustilago maydis se reportó previamente, un marco de lectura abierto de 2664 pb con homología a helicasas de la subfamilia RecQ, albergada en la región subtelomérica a la cual se le denominó UTASa, la cual es repetitiva, altamente conservada, y se encuentra localizada casi exclusivamente en el extremo de los cromosomas. Estas secuencias asociadas a telómero, forman un mosaico de secuencias moderadamente repetidas que están situadas adyacentes al repetido telomérico en prácticamente todos los organismos. Las secuencias asociadas a telómero parecen no ser esenciales para el mantenimiento del telómero, sin embargo han sido implicados en la propagación del silenciamiento transcripcional, y aislamiento del mismo efecto, como sitio preferido de eventos de recombinación y estabilización de vectores extracromosómicos. En este trabajo, decidimos investigar el papel de la posible helicasa albergada en el elemento UTASa; el primer paso fue buscar la expresión de este marco de lectura abierto (denominado HORF1) por ensayos de RT-PCR. Nuestros resultados indican que el HORF1 se expresa en una cepa con un alto número de repetidos de UTASa, pero no se detectó en una cepa con bajo número de repetidos. Nuestros resultados sugieren un efecto por posición al telómero sobre el gene putativo o defectos estructurales que llevan a la anulación de la expresión en esta cepa por lo que posiblemente no sea necesaria estructural ni funcionalmente. Los ensayos preliminares de sincronización indican que la expresión del HORF1 pudiera llevarse a cabo durante G2/M, lo cual no concuerda con lo reportado por helicasas RecQ, por lo que probablemente no se trata de una verdadera helicasa ReQ.
Busqueda del degradosoma de RNA de Bacillus subtillis
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2002) Cordova Arias, Israel; Vazquez Cruz, Candelario; Olmedo Alvarez, Gabriela
La estabilidad del RNA mensajero (mRNA) es un medio importante por el cual la expresión del gen es controlada. Muchos de los trabajos sobre el recambio del mRNA en bacterias se ha hecho en Escherichia coli, y poco es conocido acerca de su degradación en B. subtilis (Vázquez-Cruz y Olmedo-Alvarez, 1997). Se han hecho importantes avances en los pasados 10 años con la caracterización de elementos en el RNA que actúan en cis y de proteinas celulares que actúan en trans para el control del decaimiento del mRNA. En E. coli se han descrito principalmente cuatro ribonucleasas: dos endonucleasas (RNasa E y RNasa III) y dos exonucleasas (polinucleótido fosforilasa o PNPasa y RNasa II) con actividad 3'->5". Adicionalmente se ha descrito la participación de la poli(A) polimerasa (Grunberg-Manago, 1999). La RNasa E y la PNPasa se encuentran en un complejo multienzimático llamado degradosoma. En este complejo se incluye a la RNasa E, PNPasa, una helicasa dependiente de ATP (RhIB) miembro de la familia DEAD, y la enolasa, que es una enzima glicolitica (Py y cols., 1994). También hay proteínas adicionales asociadas a este complejo como proteinas de choque térmico, las chaperonas GroEL y Dnak, y la polifosfato cinasa, cuyo papel dentro del degradosoma es desconocido. En un estudio hecho en B. subtilis por Bechhofer en 1998 se reportó el primer análisis de la deleción en el gen pnp, que codifica para la PNPasa, indicando que la degradación del mRNA no fue severamente afectada a pesar de que en otros reportes se aseveró que la PNPasa es la principal exoribonucleasa 3'- >5' (Bechhofer y Wang, 1998). En B. subtilis no se conoce un homólogo la RNasa E de E. coli, que además de ser la principal endoribonucleasa, es la proteína que ancia al resto de proteínas del degradosoma. De igual forma, no se conocen otras exonucleasas similares a las más importantes en E. coli. Debido a que hay poca información acerca de los mecanismos coordinados de degradación del RNA en B. subtilis, en principio es necesario identificar los genes de las proteinas que posiblemente participen en la degradación del mRNA, con el fin de tratar de esclarecer si en B. subtilis existe un degradosoma de mRNA similar al de E. coli. Por medio de PCR amplificamos las secuencias de los genes pnp y yqfr que codifican respectivamente para las proteínas PNPasa y la helicasa YqfR de B. subtilis. Esta última es homóloga a la helicasa RhiB de E. Coli (34% de identidad). Las secuencias se clonaron en el vector de expresión pTrcHisA. Ambas secuencias expresaron péptidos de 84 kDa para la proteína PNPasa y de 49.8 kDa para la proteína YqfR. Se secuenció la parte N- terminal de cada una de las proteínas y las secuencias obtenidas de las dos proteínas fueron idénticas a las reportadas en el banco de genes. Purificamos a las 2 proteínas por cromatografía en columnas de níquel y se analizó la interacción de estas proteínas con extractos de B. subtilis crecidos a 30 y 37°C y también bajo un gradiente de glicerol del 10, 20 y 30%. En el análisis de interacción de proteínas PNPasa y YqfR hecho en este trabajo bajo ninguna condición se observó la presencia de alguna otra proteína asociada. De acuerdo con nuestros resultados es posible no exista el degradosoma en B. subtilis como el descrito en E. coli.
Caracteriación de secuencias involucradas en la secreción de proteasas en Pasteurella multocida
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2005) Juárez Escalante, Miriam; Vázquez Cruz, Candelario; Negrete Abascal, Erasmo
P. multocida es una bacteria gram negativa que infecta a una gran variedad de animales y en algunas ocasiones al humano. Se conocen algunos factores de virulencia de los cuales se vale este microorganismo para ingresar, colonizar e infectar a su hospedero, pero la participación de las proteasas como factor de virulencia no esta claramente establecida. Se han realizado diversos trabajos enfocados en el estudio de las proteasas secretadas por algunos miembros de la familia Pasteurellaceae, pudiendo ser detectados en especies del género Actinobacillus, Haemophilus y Pasteurella. Algunas de estas proteasas secretadas han sido clasificadas como metaloproteasas ya que son inhibidas por EDTA, EGTA y reactivadas por calcio. Así mismo, son capaces de degradar inmunoglobulinas. Una limitante que ha sido detectada para estudio de las proteasas secretadas de P. multocida es que existe una fuerte regulación en la expresión de estas proteasas por parte de la bacteria, que las expresa in vitro únicamente durante las primeras resiembras en el laboratorio, apagando su expresión en posteriores resiembras, lo que dificulta su obtención. Luna Rivero, en el 2003, logro clonar y mantener estable en E. coli la expresión de una proteasa de P. multocida; la caracterización de esta proteasa indicó que se trataba de una metaloproteasa neutra, estable desde 25°C hasta 40°C, y con reactividad cruzada con anticuerpos elaborados contra una proteasa de A. pleuropneumoniae. En este trabajo, se procedió a la clonación de los genes pqqL y lon en un sistema heterologo, mediante técnicas de biología molecular. Los genes clonados se secuenciaron y su actividad proteolitica se analizó en placas con sustrato. Mientras que el análisis de las proteínas secretadas en diferentes etapas de crecimiento de cada una de las clonas se realizó con el uso de zimogramas. Es necesario conocer de manera más clara el papel que desempeñan las proteasas secretadas por P. multocida como factores de virulencia para en un futuro poder desarrollar estrategias terapéuticas en contra de este microorganismo.
Caracterizacion de la respuesta al estrés termico "IN VITRO" y clonacion del gene rpoE de Yersinia pseudotuberculosis
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2003) Suarez Albores, Patricia Guadalupe; Martinez Morales, Javier; Baca Beatriz, E.
Yersinia spp son bacilos Gram negativos, acrobios facultativos, generalmente intracelulares, móviles cuando son aislados del medio ambiente, pero no móviles en el hospedero. El género tiene tres especies de gran importancia médica, debido a que pueden causar enfermedades en humanos, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis, de las cuales esta última es la especie más invasiva, siguiéndole Y pseudotuberculosis y por último Y. enterocolitica (Straley et al., 1993). Las infecciones debidas a Y. enterocolitica y Y. pseudotuberculosis son adquiridas por ingestión de alimentos o agua contaminada. Ambas especies son ubicuas en el medio ambiente; en el humano Y. enterocolitica puede causar varios cuadros clinicos, entre los que tenemos: enteritis, enterocolitis y linfadenitis mesentérica (Bottone, 1997; Noll et al., 1996). Y. pseudotuberculosis es un patógeno que infecta principalmente pájaros y mamíferos causando la enfermedad conocida como pseudotuberculosis; ocasionalmente puede infectar al humano, provocando un cuadro clinico similar al causado por Y. enterocolitica Estas dos especies generalmente causan infecciones auto limitantes. En niños y adultos inmunocomprometidos pueden ocasionar infecciones sistémicas asociadas con endotoxemia (Abigail et al., 1994). Y. pestis, a diferencia de las otras 2 especies, penetra al hospedero por picadura de pulga o por transmisión directa (aerosoles), causando la enfermedad conocida como peste bubónica, o muerte negra (Abigail et al., 1994). Las tres especies presentan tropismo por tejido linfoide, aunque Y. enterocolitica y Y. pseudotuberculosis tienen mayor afinidad por las placas de Peyer's, las cuales se encuentran situadas en el intestino delgado (Abigail et al., 1994; Cheng & Scheewind, 1999). La interacción de Yersinia con células de mamífero, se ha estudiado bioquimica y genéticamente, identificándose asi varios factores involucrados en la adhesión (Yang et al., 1996). Isberg y col. (1988) identificaron en Y. pseudotuberculosis un gene cromosomal, llamado inv (por invasión) que codifica para una proteína de 103 kDa. Esta se localiza en la membrana externa bacteriana y se adhiere a células de mamífero, a través de un receptor de la familia ẞ1-integrina. La síntesis de esta invasina es regulada por temperatura, expresándose mejor a 28 °C (Abigail et al., 1994; Bottone, 1997; Simonet et al., 1992; Yang et al., 1996). Simonet y Falkow (1992) identificaron un gene cromosomal en Y. enterocolitica, llamado ail (attachment-invasion locus), que codifica para una proteína de 17 kDa, la cual permite a la bacteria unirse a cultivos de líneas celulares de mamíferos. Genes homólogos a ail también se encuentran en el cromosoma de Y. pseudotuberculosis y Y. pestis, cuya expresión es regulada por temperatura (37°C) (Bottone, 1997; Simonet & Falkow, 1992). En Y. pestis y Y. pseudotuberculosis se ha caracterizado una adhesina cuya secuencia presenta semejanza a las subunidades del pilus bacteriano. Se conoce como PsaA (pH 6 adhesina) debido a que se expresa mayoritariamente a pH 6. El locus que codifica para esta adhesina ha sido caracterizado en estas dos especies, encontrándose tres genes psaE, psaA, y psaB, de los cuales el producto del segundo gene corresponde a la adhesina correspondiente. En Y. enterocolitica ha sido caracterizada una estructura genética similar al locus psa, la cual se conoce en esta especie como myf (mucoid Yersinia factor). Se sabe que Myf y Psa son similares en cuanto a su regulación y estructura, y es posible que ambas promuevan eventos de adherencia en el hospedero (Abigail et al., 1994; Yang et al., 1996). Otro factor de adherencia determinado en las tres especies, es la proteína Yad/A (Yersinia adherence), la cual es codificada por el plásmido pYV. Esta proteína reconoce en la célula epitelial receptores de la familia ẞ1-integrina. Al igual que la proteína Ail su expresión es regulada a 37 °C (Abigail et al., 1994; Bottone, 1997). En Y. enterocolitica se ha determinado la síntesis de una enterotoxina termoestable conocida como Yst, que está codificada en el cromosoma y presenta propiedades estructurales, fisicoquímicas e inmunológicas similares a la toxina ST de E. coli enterotoxigénica (Mikulskis et al., 1994). La expresión de Yst depende de la fase de crecimiento, temperatura, osmolaridad y pH (Abigail et al., 1994; Mikulskis et al., 1994). Las tres especies patógenas de Yersinia, comparten la presencia de un plásmido de 70-75 kb, el cual es comúnmente conocido como el virulon Yop o plásmido pYV. Este plásmido presenta una serie de genes los cuales codifican para un sistema de secreción tipo III antihospedero, que permite la liberación de proteínas efectoras (conocidas como Yops) en el citoplasma del hospedero (Cornelis et al., 1998) Este plásmido se ha secuenciado completamente en las tres especies, encontrándose aproximadamente 50 genes involucrados en virulencia; un total de 35 genes codifican para la maquinaria de secreción y translocación (Ysc), estos se localizan en una región específica del plásmido, flanqueada en ambos lados por los genes que codifican para las proteínas efectoras Yops (Yersinia outer proteins) y sus chaperonas (Syc). Ensayos realizados in vitro indican que la secreción de las Yops ocurre solamente a 37 °C y en ausencia de calcio. Esta termorregulación esta bajo el control del activador transcripcional VirF (denominado LcrF en Y. pestis y Y. pseudotuberculosis) (Cornelis et al., 1998; Cheng & Scheewind, 1999). Las cepas curadas de este plásmido de virulencia, presentan deficiencia en colonizar el intestino de ratón y no causan infección diseminada (Abigail et al., 1994). Y. pestis tiene 2 plásmidos adicionales que no se encuentran presentes en las otras 2 especies patógenas, uno de 110 kb, y el otro de 9.5 kb (Abigail et al., 1994). El género Yersinia al igual que muchos patógenos microbianos, cuando entran al hospedero se enfrentan a factores estresantes, como son pH, temperatura, fagocitosis, etc. El patógeno, para protegerse de estos factores, activa varios mecanismos de resistencia, uno de los cuales es el aumento en la síntesis de un grupo de proteínas conocidas como proteínas de estrés (Sp), cuando el estrés es térmico, se les conoce como proteínas de choque térmico ("Heat shock proteins", Hsp) o de estrés calórico.
Caracterización enzimática de la Hemaglutinina Neuraminidasa de la cepa vacunal urabe AM9 del virus de la parotiditis humana
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Baños Lara, Ma. Del Rocío; Reyes Leyva, Julio Roberto
La cepa vacunal Urabe AM9 del virus de parotiditis se ha asociado con la presentación de brotes de meningitis posvacunal. La cepa contiene dos poblaciones con diferencias en el nucleótido 1081 del gen de la Hemaglutinina-Neuraminidasa: una de ellas presenta Adenina y la otra Guanina, lo que da lugar a diferentes fenotipos en el aminoácido 335 de la HN: HNA1081 expresa Lisina, mientras que HNG1081 expresa ácido glutámico. La HN juega un papel determinante durante el proceso infeccioso ya que mediante ella se realiza el reconocimiento del receptor celular y la actividad de neuraminidasa es importante para la salida de la progenie viral, entre otras actividades. La reversión a la virulencia se ha atribuido a la presencia del genotipo HNA1081, ya que éste es el que se ha aislado de pacientes con meningitis. Se han realizado estudios de la composición genética de las clonas pero no se sabe si existen diferencias en sus actividades biológicas. Es probable que la sustitución de A por G en HN1081, modifique las propiedades biológicas de ambas poblaciones y que estas diferencias participen en la reversión a la virulencia. En nuestro grupo se separaron dos poblaciones de la cepa vacunal con genotipo diferente denominadas: HN-A2 y HNG-3. El objetivo de este trabajo fue estudiar las actividades de la Hemaglutinina- Neuraminidasa de las clonas HN-A2 y HN-G3 de la cepa vacunal Urabe AM9. Los sobrenadantes de cultivos celulares infectados se clarificaron y las particulas virales fueron concentradas por centrifugación a 31,000 xg. Las condiciones óptimas de reacción para la neuraminidasa de ambas clonas fueron: a 37°C, a un pH de 3.5, por 30 minutos y en presencia de MgCl2 5mM. La actividad neuraminidasa se determinó mediante el método del ácido tiobarbitúrico modificado usando los sustratos: sialil(x2,3)lactosa, sialil(x2,6)lactosa, mucina, fetuina, ácido colominico y ácido 2'(4-metilumbeliferil)-a-D-N- acetilneuraminico. Ninguno de los sustratos naturales probados fue hidrolizado exclusivamente por alguna de las dos enzimas, sin embargo la actividad de HN-A2 fué mayor que la de HN-G3; La preferencia de hidrólisis de la clona HN-A2 fue: sialil (2,3)lactosa > sialil(x2,6) lactosa > fetuina ácido colominico > mucina. HN-G3 hidroliza preferentemente: fetuina > sialil(x2,3)lactosa > sialil (2,6)lactosa > ácido colominico > mucina. La afinidad sobre sialil(2,3) lactosa fue similar para ambas clonas y la Vmáx fue de: 46.9 y 3.5 nmol/min x mg para HN-A2 y HN-G3 respectivamente. HN-A2 también hidrolizó el ácido 2'(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuraminico, mientras que HN-G3 no lo hidrolizó. El punto isoeléctrico se determinó mediante isoeletroenfoque líquido y resultó de 4.30 para HN-A2 y 4.65 para HN-G3. La actividad de la hemaglutinina se determinó mediante ensayos de hemaglutinación con 29 tipos de eritrocitos diferentes, de los cuales sólo se observaron resultados positivos para ambas clonas con eritrocitos humanos tipo O de fenotipo conocido, con ligeras diferencias: HN-A2 presentó 16 UHA, mientras que HN-G3 sólo 4 UHA. El fenotipo de los eritrocitos fue: D+, E+, c+,M+, S+, s+, P+, Fy³+, k+, Jk+, Jk+ Le-, Le+, Di+. De estos antígenos eritrocitarios, sólo M, P y Le presentan ácido neuraminico, por lo que el reconocimiento de la hemaglutinina del virus sea probablemente sobre estas estructuras. La actividad de fusión se determinó valorando la cantidad de sincicios formados y se relacionó con la actividad de neuraminidasa. La clona HN-A2 presentó mayor actividad de neuraminidasa que HN-G3. Por otra parte HNG-3 mostró mayor actividad de promoción de la fusión que HN-A2 Los resultados de estos estudios revelan que si existen diferencias en las actividades de la proteina Hemaglutinina-Neuraminidasa de las clonas HN-A2 y HN-G3 de la cepa vacunal Urabe AM9 del virus de parotiditis, estas diferencias pueden contribuir a la reversión a la virulencia tras la aplicación de la vacuna.
Caracterización funcional del MLA de una helicasa tipo RECQ en Ustilago Maydis
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Torres Solis, Ma. Santa; Sánchez Alonso, Patricia G.; Vázquez Cruz ,Candelario/Martínez Laguna, Ygnacio/Carreño López, Ricardo
Las helicasas forman parte de complejos esenciales para el metabolismo del DNA durante la replicación y la transcripción. Su papel en estos complejos es el de proveer una función motriz que permita la desunión del dúplex y el avance de la maquinaria requerida en el proceso (Matson et al., 1993; Lohman et al., 1996). Las helicasas unen un 5'-nucleosido trifosfato (NTP) y utilizan la energía liberada de la hidrólisis del NTP, para romper los puentes de hidrógeno formados entre las bases complementarias del dúplex (figura 1b y 1c) (Matson et al., 1993; Lohman et al., 1996). Estas enzimas están distribuidas ampliamente en todos los organismos, se han aislado desde en bacteriófagos hasta eucariotes superiores, lo cual nos indica que los mecanismos en los que participan están muy conservados en la naturaleza (Schimid et al., 1992). Las helicasas son ubicuas y se puede encontrar una variedad de estas enzimas en cada célula. Todas catalizan la misma reacción básica, pero poseen especificidad diferente y forman parte de diferentes complejos moleculares (Matson et al., 1993; Egelman et al., 1995; Soultanas y Wigley, 2000). El alineamiento de la secuencia primaria de varias helicasas mostró que pueden tener hasta siete motivos altamente conservados, los cuales son designados como: I, Ia, II, III, IV y VI (figura 1a) (Gorbalenya et al., 1989). En todas las helicasas se han encontrado los dominios I y II, que corresponden a los sitios Walker A y Walker B respectivamente (Gorbalenya et al, 1989; Schmid et al., 1992) que están relacionados con la unión de los NTPs. El sitio Walker A tiene la secuencia aminoacidica consenso GxGxGK(T/S) (donde x puede ser cualquier aminoácido), y sus aminoácidos forman un lazo P dentro del sitio de unión al NTP. El dominio Walker B también es conocido como la caja DEXH o DEAD, y posee un aspartato que interactúa con el NTP utilizando como cofactor al Mg 2+ (Gorbalenya et al., 1989). Otro motivo importante presente en las helicasas es el dominio VI, el cualse une a ácidos nucleicos, y es rico en residuos cargados positivamente (Gorbalenya et al., 1989). Sobre la base de la secuencia primaria de los motivos conservados las helicasas se han clasificado en dos súper familias nombradas SF1 y SF2. En las dos súper familias se conservan los siete motivos característicos, la diferencia entre ellas radica en el dominio Walker B (II) en el dominio VI. En la súper-familia SF2 se encuentra la secuencia DEAD en el segmento II y la secuencia HxxGRxxR en el segmento VI; mientras que en la súper familia SF1 estos residuos son compensados por residuos con la secuencia, DEXH y QxxGRxXR respectivamente. Tomando como base a estos dominios también se ha definido la familia F3 la cual únicamente tiene tres motivos conservados, y la familia F4 cuyos miembros conservan únicamente cinco dominios (Gorbalenya et al., 1989; Lohman et al., 1996). Las helicasas preferentemente desunen dúplex que tienen extremos de hebra sencilla flanqueando al dúplex, algunas requieren un extremo 3'y otras un extremo 5, las primeras son clasificadas como enzimas con polaridad 3'a 5'y las segundas como enzimas con polaridad 5'a 3' (Matson et al., 1993; Lohman et al., 1996). Aun no se ha dilucidado el mecanismo por el cual las helicasas desunen un dúplex de ácidos nucleicos, pero se han propuesto varios modelos. Una característica común en todos los modelos es la existencia de múltiples sitios de unión a DNA o RNA en la enzima, estos sitios de unión son esenciales para la translocación de la helicasa en el dúplex y concuerda con la noción de que las helicasas actúan como dímeros o hexámeros (figura 1c) (Matson et al., 1993; Egelman et al., 1995; Lohman et al., 1996). Aunque hasta ahora no se han hecho muchos estudios respecto a la estructura de las helicasas tipo RecQ, se ha observado que BLM y Sgs1 forman un anillo hexámerico de aproximadamente 3.5 nm que es la forma activa (Karow et al., 1999).
Caracterizacion parcial de una cinasa histidinica de Azospirillum Brasilense
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2012) Villarreal Astorga, Cynthia Teresa; Eugenia Baca, Beatriz
Las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal constituyen un amplio grupo de microorganismos del suelo, las cuales cuando se desarrollan en asociación con un vegetal promueven su crecimiento. Uno de los representantes más estudiados de este grupo es el género Azospirillum debido a que se han realizado numerosas investigaciones tanto en aspectos genéticos y bioquímicos, como de sus aplicaciones tecnológicas (Bashan et. al., 2004). Un paso clave para que las PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) ejerzan efectos de promoción del crecimiento es el logro de una efectiva colonización de las raíces. Este proceso requiere de una serie de mecanismos de señalización descritos en varios modelos bacterianos, y que en Azospirillum están poco estudiados En nuestro grupo de investigación se identificó el gene que codifica para la enzima aromático amino transferasa 1 (AAT1), codificada por el gene hisCl de A. brasilense Sp7 (Guerrero-Castro et. al., 2011). En el plasmido en el que se localizó el gene hisC1, se encontró la secuencia de una ORF parcial (la región N-terminal), que presentaba homologia con una cinasa histidinica (HPAT) Las cinasas histidinicas (HK) son proteinas implicadas en señalización que participan en la transducción de señal de los sistemas de doble componente (TCS). quienes convierten los estimulos del medio ambiente en una señal que induce una respuesta celular a través de modificaciones en la expresión de genes (Stock et. al.. 2000) Los TCS funcionan y transducen las señales del entorno a través de reacciones de fosforilación entre dos componentes conservados, una cinasa histidinica (HK siglas en inglés) y un regulador de respuesta (RR, siglas en inglés). En este trabajo se obtuvo la secuencia completa de la cinasa histidinica. El análisis in silico sugiere que en la proteina presuntamente ocurren los dominios caracteristicos de una cinasa hibrida, la localización en el genoma de A. brasilense Sp245 identificó dos genes putativos, colindantes http://genome.ornl.gov/microbial/abra, que presentan homologia con una presunta MCP (proteina de quimiotaxis de unión a metilo) y CheY Se generó la mutante por inserción de un casete de Te, cuya anotación provisional es A brasilense ABHK Te. La cual se afectó en su capacidad de movilidad. considerablemente, en medio minimo, y retardada en medio completo, en relación con Is cepa silvestre, lo que sugiere que la proteina está involucrada en quimiotaxis.
Caracterización parcial del gen motB de Gluconacetobacter diazotrophicus
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Arcila Lozano, Leslie Susana; Eugenia Baca, Beatriz; Fuentes Ramírez, Luis Ernesto/Castañeda Lucio, Miguel/Martínez Morales, Luis Javier; Castañeda Lucio, Miguel
Gluconacetobacter diazotrophicus bacilo Gram negativo, aerobio, endófito de la caña de azúcar, y recientemente aislado también de las plantas: camote dulce, sorgo, café y piña. El cual ha suscitado interés por su capacidad de fijar nitrógeno, producir sustancias que regulan el crecimiento vegetal. Que crece en altas concentraciones de sacarosa, y no presenta nitrato reductasa, además de ser ácido tolerante. Estudios realizados en caña de azúcar han indicado que cerca del 70% del nitrógeno de la planta es obtenido por fijación biológica de nitrógeno, y que G. diazotrophicus, así como otros diazótrofos endófitos podrían contribuir al estatus nitrogenado de la planta. Es una bacteria móvil que posee flagelos perítricos o laterales. Este apéndice se ha implicado en la movilidad bacteriana en medio líquido o natatorio, para desplazarse y colonizar superficies sólidas (movimiento de tipo "swarming"), en el proceso de quimiotaxis y relacionado con procesos de adhesión a la célula hospedera. Se ha descrito que se requieren alrededor de 50 proteínas para el ensamblado, y operación del flagelo bacteriano; estudios genéticos han demostrado que tres de estas proteínas (FliG, MotA y MotB) están involucradas directamente en la generación de la rotación del motor. MotA y MotB son proteínas integrales de membrana que funcionan como un canal protónico (formando el estator o la parte que no rota) del motor, mientras que FliG es componente del rotor. La proteína MotA esta constituida por cuatro hélices transmembranales y un domino citoplasmático. La proteína MotB contiene una región transmembranal y un dominio periplásmico que ancla el estator al peptidoglicano Se propone que estas proteínas forman un canal por el cual pasa un flujo iónico (protones o sodio) desde la célula hacia el rotor proporcionando la energía para que se lleve a cabo la rotación del motor. La mutación de cualquiera de los genes motAB produce un fenotipo flagelado, aunque este flagelo no es funcional (mutantes paralíticas). Si la mutación de los genes mot se restaura el flagelo adquiere movimiento de manera similar a un flagelo normal. Debido a su reciente identificación a la fecha existen pocos estudios a cerca de las estructuras de G. diazotrophicus implicadas en la colonización a su planta hospedera. Por lo que es necesario estudiar los factores que intervienen en el establecimiento de la interacción bacteria-hospedero. Es posible que la movilidad de G. diazotrophicus influya directamente en este proceso, por tanto es relevante determinar el papel que tiene la locomoción de G. diazotrophicus en el establecimiento de esta asociación. En este trabajo a través de amplificaciones por PCR se clonó parte del gen motB. La construcción de un banco genómico de G. diazotrophicus Pal 5 permitió identificar varias clonas positivas en donde pudiera localizarse el operón mot. De las clonas positivas se analizó la clona p 3-97. Se realizó un mapa físico de la clona p 3-97 utilizando diferentes enzimas y a través de una hibridación tipo Southern blot se identificó un fragmento Eco RV de 3kb. Considerando que el tamaño de motß esta reportado de entre 800-1.1kb (Platzer, et al., 1997) es sugerente se encuentre incluido la ORF putativa del gen morB en ese fragmento. Este estudio nos permitirá analizar la participación de la movilidad en el establecimiento de una colonización exitosa. De igual manera la construcción de una librería genómica permitirá continuar con estudios básicos de esta bacteria.
Caracterización parcial del orf putativo del gen gacS en Azospirillum brasilense Sp7
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Moreno Luna, Francisco Bersain; Carreño López, Ricardo; Castañeda Lucio, Miguel/Carreño López, Ricardo/Eugenia Baca, Beatriz/Fuentes Ramírez, Luis Ernesto; Castañeda Lucio, Miguel
Las bacterias del género Azospirillum, son bacterias que interactúan con plantas produciendo asociaciones benéficas, y son probablemente una de las rizobacterias promotoras del desarrollo vegetal más estudiadas a nivel ecológico, genético y molecular.
Caracterización y clonación del gen CysK que codifica para la enzima cisteína sintasa en Azospirillum brasilense Sp7
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2004) Sosa Jiménez, Araceli; Eugenia Baca, Beatriz; Eugenia Baca, Beatriz/Castañeda Lucio, Miguel/Fuentes Luis, Ernesto/Martínez Morales, Luis Javier; Eugenia Baca, Beatriz/Castañeda Lucio, Miguel/Fuentes Luis, Ernesto/Martínez Morales, Luis Javier
El género Azospirillum (subclase a de las proteobacterias), pertenece al grupo de las denominadas bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), ya que estimulan el desarrollo de las plantas que colonizan. Se considera que esta asociación es una "simbiosis asociativa" por no tratarse de una verdadera simbiosis mutualista, ya que induce cambios morfológicos y fisiológicos en las raíces de las plantas debido a la producción de hormonas de crecimiento, provocando un aumento en la toma de agua y minerales lo cual sumado a la fijación biológica de nitrógeno atmosférico pueden promover el crecimiento y rendimiento de los cultivos. La cisteína es un aminoácido esencial, único con la capacidad de formar enlaces disulfuro, funcionalmente muy importante en la estructura, estabilidad y como centro catalítico de muchas proteínas en todas las formas vida. La cisteína es también la mayor fuente de azufre, para compuestos que lo contienen, tanto en procariontes como en eucariontes. En bacterias, la cisteína es sintetizada a partir de serina, por la incorporación de azufre o tiosulfato. En el primer paso, la O-acetilserina es formada por la serina transacetilasa, producto del gen cysE; la cisteína es el producto del segundo paso de la reacción catalizada por la enzima O- acetilserina(tiol)-liasa A (en crecimiento aeróbico), u O-acetilserina(tiol)-liasa B (OASS) (en crecimiento anaeróbico), codificadas por los genes cysk y cysM, respectivamente. En este trabajo se realizó la clonación y secuenciación del gen cysk que codifica para O- acetilserina(tiol)-liasa A, de Azospirillum brasilense Sp7, se diseñaron iniciadores en base a la secuencia de los péptidos de la proteína purificada en un trabajo previo con los que mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se logró la amplificación de un fragmento 912 pb, cuya secuencia muestra un alto porcentaje de identidad con los genes cysk reportados de Brucella melitensis (75.5%), Sinorhizobium meliloti (66.5%), Rhodospirillum rubrum (65.3%), entre otros. Al hibridar con el DNA genómico total de A. brasilense Sp7 digerido con Sal 1, contra la región carboxilo terminal del gen cysk como sonda, se identificaron tres bandas, mientras que la hibridación con el amplificado de 912pb, muestra sólo una banda; lo que sugiere la presencia del gen cysM. Para respaldar esta hipótesis, se realizó la mutación del gen cysk de A. brasilense Sp7, dicha mutante no muestra auxotrofia a cisteína (Ramirez Mata, datos no publicados) Mediante los ensayos de complementación de la cepa de E. coli NK3 auxótrofa de cisteína (cysk, cysM), con el amplificado de 912 pb clonado en vector de expresión pBAD-TOPO, se probó la funcionalidad del gen cysk de A. brasilense Sp7.
Clonacion del gen y caracterizacion parcial de una proteasa de Pasteurella multocida
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2003) Luna Rivero, Maria Juana Norma; Vazquez Cruz, Candelario; Negrete Abascal, Erasmo
Pasteurella multocida es un bacilo gram negativo, aerobico facultativo capsulado, no movil que no forma esporas, de amplia distribucion en todo el mundo. Forma parte de la flora normal de nasofaringe tracto gastrointestinal y genital de muchos animales domesticos y salvajes. Esta bacteria pertenece a la familia Pasteurellaceae, en las que tambien se encuentran otros generos como Haemophilus y Actinobacillus. P. multocida ha sido extensamente estudiada desde que aislo por primera vez a finales de 1870 En epocas recientes la aplicación de nuevas tecnologias ha ampliado el conocimiento del microorganismo y su epidemiologia. Sin embargo algunos de los mecanismos moleculares que participan en la infeccion y virulencia de P. multocida aun son desconocidos y este organismo continua causando un amplio rango de enfermedades en aniamles y humanos. P multocida es el agente causal del colera de las aves, septicemia hemorragica en ganado vacuno, rinitis atrofica y neumonia en cerdos y la mas comun fuente de infeccion de tejidos en humano debido a mordeduras de perros y gatos. Con menor frecuencia la bacteria se ha asociado con infecciones que afectan diferentes organos o sistemas del ser humano, por ejemplo se descubrio un caso de meningitis causada por P. multocida al practicar la autopsia de un hombre de 52 años. La bacteria se transmite de animal a animal principalmente por via aerea a traves de aerosoles. Se cree que la invasion tambien puede ocurrir a traves de tejidos linfoides del tracto respiratorio. Otras posibles rutas de transmision son por ingestion, contacto secual, paso a traves del canal de nacimiento. Los brotes agudos de pasteurelosis puedes ocurrir por la transmision por ectoparasitos y por medio de fomites y moscas P. multocida puede diferenciarse de otras bacterias de la familia Pasteurellaceae Porque produce indol, ornitina descarboxilasa, catalasa y oxidasa; fermenta glucosa, sacarosa y sorbitol. No crece en agar MacConkey, no utiliza citrato ni lactosa: no produce la enzima ureasa, crece mejor a 35-37`C en medios como agar dextrosa almidon (DA) infusion de cerebro corazon (BHI) agar sangre (AS) y agar soya tripticasa (TSA) formando colonias que miden de 1 a 3 mm de diametro despues de 18 a 24 horas de incubacion de apariencia discreta circular, convexa y butirosa.
Clonación y secuenciación de componentes de un presunto transportador para el fierro, tipo ABC de Gluconacetobacter diazotrophicus
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2003) Sánchez Espíndola, Adriana; E. Baca, Beatriz
En la búsqueda de genes que codifican para el complejo oxidasa terminal a, de Gluconacetobacter diazotrophicus, se realizó un escrutinio de un minibanco construido en el plásmido pSUP202 donde, se clonaron fragmentos del genoma de G. diazotrophicus obtenidos por digestión con EcoRI; empleando como sonda una región de 400 pb obtenida por reacción de PCR; de este estudio se obtuvieron dos clonas, se procedió a la purificación de estos dos plásmidos recombinantes, los cuales contienen insertos de una longitud de 5.4 y 3.1 Kb (nombrados pAD001 y pAD002, respectivamente). La determinación del mapa de restricción de pAD001 indicó la presencia de sitios de restricción, que sirvieron para subclonar y obtener los plásmidos pAD191 y pAD131, de 1.9 kb y 1.3 kb respectivamente. Se determinó la secuencia de nucleótidos de ambos plásmidos. El análisis de la secuencia de pAD191 mostró dos fases de lectura abierta, denominados ORF1 (192 aminoácidos) y ORF2 (secuencia parcial de 64 aminoácidos). El análisis BLASTP indicó la siguiente homología: identidad de 41% y 54% de similitud del ORF 1 con una PBP (por sus siglas en inglés, Periplasmic binding protein); e identidad de 55% y 75% de similitud para el ORF 2 con una proteína integral de membrana, denominada dominio transmembranal TMD; cuyos productos de traducción indican la presencia de presuntas proteínas componentes de un sistema putativo de transporte de hierro (Fe) tipo ABC. Aunque los porcentajes identidad/similitud del ORF 1 son significativos, solo se obtuvo una secuencia parcial (correspondiente al presunto extremo carboxilo terminal ), por lo que estudios adicionales son requeridos. La homología más significativa del ORF2 concierne a una proteína de Zymomonas mobilis. Alineamientos adicionales tipo CLUSTALW indicaron que, aunque en menor grado esta presunta proteína también muestra homología significativa con otras proteínas integrales de membrana y componentes de un sistema de transporte para el Fe, de otras bacterias. La secuencia obtenida de pAD131 mostró también dos fases de lectura abierta (ORF2 con 279 aminoácidos y ORF3 con 285 aminoácidos); mediante el análisis BLASTP se identificó homología (identidad 44% y similitud 61%) del ORF 2 con el extremo carboxilo terminal de la proteína integral de membrana putativa de Z. mobilis, cuya región amino terminal se encuentra contenida en el ORF2 de pAD191. El ORF2 está constituido de 343 aminoácidos, con un peso molecular de 34,417 Da y un pl teórico de 9.2. La ORF3 reveló una identidad de 55% y similitud de 68% con el componente de unión a ATP, los cuatro motivos característicos de estas proteínas fueron localizados en la secuencia, que contiene 286 amino ácidos y un peso molecular estimado de 30,318 Da y un pl teórico de 11.3. En el presente estudio se identificaron 3 fases de lectura abierta (ORFs) que presuntamente codifiquen para componentes de un sistema de transporte tipo ABC para Fe en G. diazotrophicus. Los datos obtenidos indican que en el plásmido pAD001 ocurren genes ortólogos de un sistema de transporte tipo ABC para Fe descritos en Escherichia coli, Haemophilus influenzae, y la cianobacteria Synechocystis sp, cuya organización es sugerente de un operón. Con el fin de iniciar la caracterización de este sistema de transporte tipo ABC se obtuvo una mutante por reemplazo alélico con un cartucho de resistencia al antibiótico kanamicina, la mutante se analizó por hibridación DNA/DNA y amplificación, para corroborar la inserción del cartucho.
Determinacion de un marcador molecular para la tipificacion e identificacion de Haemophilus Influenzae
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2003) Garcia Zacarias, Claudia M; Martinez Laguna, Ygnacio; Fuentes Ramirez, Luis Ernesto; Rocha Gracia, Rosa del C
Haemophilus influenzae está ampliamente distribuido y adaptado a la población humana, usualmente presente en nasofaringe de niños y adultos saludables, sin causarles daño, a menos que logre vencer el sistema inmune. Es raro encontrarlo en cavidad oral y no se ha detectado en otra especie animal (Tang et al., 2001) Haemophilus influenzae, es un cocobacilo Gram negativo de 1 x 0.3 µm, aerobio o anaerobio facultativo, pleomórfico, no móvil, no forma esporas, no produce exotoxinas demostrables y pertenece a la familia Pasteurellaceae. Se subdivide en formas con y sin cápsula (Rao et al., 1999; Tang et al., 2001). Son dos los sistemas establecidos para la clasificación de H. influenzae: 1) producción de capsula, que a su vez se subdivide en seis tipos serológicos: a-f y 2) biotipificación, en base a tres pruebas bioquímicas: producción de indol, ureasa y ornitina descarboxilasa (Saito et. al., 1999); además Foxwell et al., (Foxwell et al., 1998) consideran 1) diferenciación por peso molecular o 2) por heterogeneidad antigenica de proteinas de membrana externa (PME); 3) clasificación por heterogeneidad antigenica de lipooligosacárido (LOS); 4) determinación de diferencias genéticas por tipificación electroforética; 5) polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción y 6) amplificación por PCR como posibles sistemas de clasificación. Haemophilus influenzae para su crecimiento requiere de un medio complejo con factores de crecimiento presentes en la sangre, especificamente los factores X (hemo). V (NAD O NADP*) y IX (protoporfirina o protohemoglobina que contenga hierro), además de CO₂. Crece en forma óptima entre 35 y 37°C y es quimiorganotrófico y parásito obligado de las membranas mucosas de humanos (Foxwell et al., 1998, Rao et al., 1999; Tang et al., 2001). La patogénesis de infecciones por H. influenzae aún no se entiende en su totalidad, se sabe que la presencia del polisacárido capsular es el principal factor de virulencia. Los microorganismos encapsulados penetran el epitelio de la nasofaringe e invaden los capilares sanguineos directamente. Su cápsula les permite resistir a la fagocitosis y a la lisis mediada por complemento en el hospedero no inmune. Las cepas de HiNT no poseen cápsula, son menos invasivas, pero son capaces de inducir una respuesta inflamatoria causante de enfermedad (Todar, 1999). H. influenzae tipo b es el serotipo más virulento, porque se involucra en forma más frecuente en la producción de infecciones meningeas en niños; por el contrario, en los adultos las cepas no tipificables de H. influenzae son la causa común de infecciones y se presume que adquieren anticuerpos en forma natural contra la cápsula tipo b (Todar, 1999). Prácticamente todos los pacientes con meningitis por H. influenzae, tratados en forma temprana, se recuperan. El grado de mortalidad es inferior al 10%, pero cerca del 30% de los niños recuperados sufren efectos neurológicos residuales como retardo mental, pérdida de la audición y alteración de lenguaje. La ampicilina es el antibiótico de elección, pero 20% o más de las cepas de H. influenzae son resistentes, debido a la producción de ẞ-lactamasa mediada por un plásmido (Todar, 1999). Las observaciones de transformación genética en H. influenzae incluyen resistencia a drogas y sintesis de antígenos capsulares específicos. La transformación de H. influenzae ocurre por diferentes mecanismos y es más eficiente que en las bacterias entéricas. Cuando se encuentra en competencia, la bacteria desarrolla vesículas en la membrana externa, llamadas transformasomas, que contienen una proteina especifica de unión a DNA. Esta proteína reconoce una secuencia específica de DNA de 11 pares de bases (pb) que aparece en el DNA de Haemophilus con mayor frecuencia que en otros géneros de bacterias. Haemophilus es capaz de sufrir transformación interespecie e intraespecie in vivo (en tejidos del hospedero) (Malin et al, 1999; Todar, 1999).
Diversidad bacteriana asociada a la enfermedad pink disease de la piña
(Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2005) Marin Cevada, Vianey; Fuentes Ramírez, Luis Ernesto
La planta de piña [Ananas comosus (L.) Merr] pertenece al orden Bromeliales, de la familia Bromeliacea y subfamilia Bromelioidene. La familia de las Bromeliaceas comprende 56 géneros con 2,794 especies. Se distribuye ampliamente en el Nuevo Mundo y muestra una gran adaptación en un vasto rango de hábitats (Luther y Sieff, 1998), Las Bromeliáceas presentan una interesante graduación desde formas primitivas hasta otras muy evolucionadas, con enormes variaciones de tamaño y adaptaciones al medio ambiente. Agrupa plantas terrestres con tallos alargados, raíces desarrolladas por completo, hojas con peciolos estrechos y una densa cobertura pubescente que retrasa la pérdida de agua. Aparentemente, la piña fue domesticada por los nativos del sur de Brasil y Paraguay, después fue distribuida por Sudamérica y llevada a Centro América y México antes de la llegada de los europeos. Por su alto grado de domesticación y selección, Cristóbal Colón la introdujo en Europa. Posteriormente, fue trasladada a otros países; originando así el desarrollo y la expansión del comercio mundial de la piña a partir del siglo XVII. Se caracteriza por ser una planta monocotiledónea, herbácea, perenne, alógama, de reproducción autoincompatible y principalmente asexual (Luther y Sieff, 1998). Además, es la tercera fruta tropical más importante en un plano de producción global después del plátano y el limón. Tailandia, Filipinas, Brasil, China, India, Costa Rica, México y Colombia son considerados como los principales países productores de piña, comercializando como fruta fresca y para la industria de enlatados (Bartholomew et al., 2003).

Browse

Browsing Teis de Maestría by Career "Maestría en Ciencias (Microbiología)"

Results Per Page

Sort Options